蛋白桑：桑叶提取物的抗病毒活性检测

 摘 要 桑叶作为中药或功能饮品的重要成分在民间和临床上广泛应用。用 70% 乙醇对广东桑、 白桑、 鸡桑、 鲁桑等桑种共 20 个品种的桑叶进行浸提， 并依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取得到不同萃取组分及剩余水相组分。利用细胞病变减少 法（ CPE 法） 检测发现多个桑叶样品的萃取组分或水相组分含有抗病毒活性物质， 且抗病毒活性具有选择性。其中， 能有效抑 1） 6 1 制单纯疱疹病毒 1 型（ HSV- 的样品最多， 个桑品种桑叶的乙酸乙酯萃取组分对 HSV- 的半数抑制浓度 （ IC50 ） ≤12. 5 μg / mL； 广东桑品种桑叶的水相组分和石油醚萃取组分具有较高的抗甲型流感病毒（ Flu A） 活性； 部分桑品种桑叶的萃取组分 对登革病毒 2 型（ DV2） 也有一定的抑制活性； 20 个桑品种桑叶的 4 种萃取组分对柯萨奇 B3 病毒（ CVB3） 均无抑制活性。上 述结果表明桑叶含有丰富、 较为广谱的抗病毒活性成分， 但不同桑品种间的桑叶化学成分及抗病毒活性有一定差异。 

人类的传染病约 75% 由病毒引起， 尤其近年来 新现或再现病毒感染不断引发新的疾病流行 ， 因此 病毒感染的防治再次成为人类关注的热点 。桑叶提取物的抗病毒活性检测 953 科桑属 （ Morus L． ） 落叶性多年生木本植物， 其叶 。 桑叶不仅含有丰富 枝 根皮和果实均为传统中药 ， 还具有多种药理学活性 作为单方或复方在临床上应用 ， 适应症很广。 以桑叶为 它成分及含量均与生长液相同。4 种病毒分别在相 实验 应的宿主细胞内增殖后分装并保存于 － 80 ℃ ， 以 前检测病毒滴度， 50% 组织细胞感染剂量 （ 50% TCID50 ） 表示。 tissue culture infective dose， 1． 3 桑叶来源及各萃取组分制备 本试验以广东桑、 白桑、 鸡桑、 鲁桑及中间型桑 的营养物质主要或核心原料的广东凉茶及中成药夏桑菊的民间 应用历史悠久， 在广东及华南地区用于清热解毒 、 预 防或 治 疗 感 冒 及 上 呼 吸 道 感 染， 毒 副 作 用 小。 且 2009 年甲流暴发时， 桑叶作为重要的成分在多种中 药预防配方或饮食中出现。 目前， 针对桑白皮抗病 ， 毒活性及成分的研究较多 对桑叶的化学成分 ， 但桑叶化学成分的抗病毒 、 活性仅有对抗单纯疱疹病毒（ HSV） 呼吸道合胞 也有较深入的研究 及人类免疫缺陷病毒 （ HIV） 的少 病毒（ RSV） 尚缺乏系统的研究。此外， 受品种、 产地、 生 量报道， （ 种间杂交） 共 20 个品种（ 表 1） 的桑叶为材料， 样品 桑叶均采自国家桑树种质资源分圃 。 将采集的各品种桑叶自然干燥后分别取 100 g， 用 70% 乙醇浸提 3 次， 合并提取液， 减压回收溶剂 得乙醇粗提浸膏。粗提浸膏分别加适量蒸馏水混悬 后依次用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取 3 ～ 5 次， 各 得到 20 个桑 萃取组分旋转蒸发回收溶剂至无气味 ， 乙酸乙酯萃取组分、 正 品种桑叶的石油醚萃取组分、 丁醇萃取组分和剩余水相组分。 分别称取 20 个桑 品种桑叶的 4 种组分共 80 个样品适量， 用二甲基亚 砜（ DMSO） 配制成质量浓度为 40 mg / mL 的母液于 － 20 ℃ 保存， 测 前 用 细 胞 维 持 液 稀 释 至 所 需 检 浓度。 1． 4 桑叶萃取组分体外抗病毒活性检测 1． 4． 1 初筛 将 供 试 病 毒 的 宿 主 细 胞 接 种 于 96 孔板后培养 24 h 生长为单层 ， 测试前吸弃培养液 。 桑叶各 萃 取 组 分 样 品 用 细 胞 维 持 液 稀 释 为 200 μg / mL， 在各孔分别加入 50 μL， 每个样品重复 4 孔， 随即将 50 μL 病毒悬液 （ TCID50 = 100） 分别加入相 应的培养孔使样品的终浓度为 100 μg / mL。 每块孔 板同时设细胞对照组 （ 加入 100 μL 细胞维持液 ） 、 病毒对照组（ 加入细胞维持液和病毒悬液各 50 μL） 和阳性药物对照组（ 加入 ACV 或利巴韦林溶液和病 毒悬液各 50 μL） 。 轻摇混匀后置于 CO2 培养箱中 37 ℃ 培养 36 ～ 72 h， DV2 于 28 ℃ 培养。 每天观察 由病毒引起的细胞病变效应（ CPE） 。当病毒对照组 CPE 为 100% 时， 记录各孔产生 CPE 的情况。 1． 4． 2 复 测 选 取 能 使 细 胞 CPE 减 少 （ 即 孔 中 CPE 为 “+++ ” 以下） 的样品进行复测。首先将样品 用细胞维持液做 2 倍梯度稀释， 按上述方法培养细 胞并感染病毒， 同时加入稀释好的样品， 使样品的终 12. 25、 100 μg / mL， 浓度为 6. 25、 5、 50、 各浓度样品 重复 4 孔， 置于 CO2 培养箱中 37 ℃ 培养， 每天观察 CPE 产生情况直到病毒对照组 CPE 为 100% 。根据 显微镜下各浓度样品处理后受病毒感染的细胞出现 CPE 的程度， 估算不同来源桑叶各萃取组分对病毒 长季节等因素的影响， 桑树的主要活性成分表现出 。本研究选择几个桑种的不同品 一定的差异性 种的桑叶为材料， 以不同溶剂萃取其活性成分， 并检 测桑叶样品中不同萃取组分对多种病毒的体外抗性 活性， 以期为桑叶抗病毒活性成分鉴定及其功能食 品或药物的开发提供理论依据。 1 1． 1 材料与方法 主要试剂 RPMI 1640 培养基 （ 美国 Gibco 公司 ） ， 新生牛 血清（ 杭州四季青生物工程公司） ， 胰酶 （ 美国 Sigma 公司 ） ， 昔 洛 韦 （ ACV， 国 Wellcome Foundation 阿 英 公司） ， 利巴韦林 （ ribavirin， 广州白云山天心制药股 份有限公司） 。 1． 2 细胞株和病毒株 非洲绿猴肾细胞 Vero 和单纯疱疹病毒 1 型标 准 株 （ herpes simplex virus type 1 standard strain， HSV- ， 1） 狗肾细胞 MDCK 和 甲 型 流 感 病 毒 A / E13 （ H1N1） 株 （ influenza A / E13 H1N1， A / E13） ， Flu 喉 癌细胞 HEp2 和柯萨奇 B3 病毒 （ coxsackievirus B3， CVB3） ， 蚊子细胞 C6 /36 和 登 革 病 毒 2 型 （ dengue virus type 2， DV2） ， 所有细胞株及病毒株均由暨南 大学医学院微生物学实验室传代保存 。 各宿主细胞接种在含有 10% 热灭活新生牛血 清和 青 霉 素 / 链 霉 素 双 抗 （ 各 100 U / mL） 的 RPMI 1640 生长 液 （ growth medium， GM） 中， 相 对 湿 度 在 95% 、 ℃ 、 CO2 的培养箱中培养。细胞维持液 37 5% （ maintain medium， MM） 除含 1% 新生牛血清外， 其 954 蚕 业 科 学 2011； 37 （ 5） 的 半 数 抑 制 浓 度 （ 50% inhibitory concentration， IC50 ） 17 。病毒对照组 CPE 为 100% 时记为 “++++ ” ， 7 叶的水相组分能抑制 DV2 的体外增殖， 个品种桑 DV2 显示出较好的抗性活 叶的石油醚萃取组分对 分别有 2 个品种桑叶的乙酸乙酯萃取组分和 4 性， 个品种桑叶的正丁醇萃取组分具有抗 DV2 的活性。 由此可见， 多数品种的桑叶中含有抗病毒活性 物质， 这些活性物质分别为不同溶剂的萃取组分 ， 并 且对不同的病毒具有选择性的抗性活性， 表明不同 桑品种的桑叶化学成分及抗病毒活性均有差异 。 2． 2 供试桑品种的桑叶萃取组分对不同病毒的抗 性活性分析 2． 2． 1 抗 HSV- 活性 20 个品种桑叶的石油醚萃 1 1 取组分虽然有一定的抗 HSV- 活性， 但活性较低， 1 对 HSV- 的 IC50 值≥25 μg / mL（ 表 1） 。桑叶的乙酸 1 广东 乙酯萃取组分抗 HSV- 活性更为明显。 其中， 5、 7 桑的 41- 98- 两 个 品 种 桑 叶 中 该 组 分 的 活 性 最 IC 强， 50 值均 ＜ 12. 5 μg / mL； 其次是鸡桑的马大 2、 北 2 和鲁桑的湘引 3 号以及中间型桑的农桑 10 号， 东 这 4 个品种桑叶的乙酸乙酯萃取组分也能很好地抑 1 IC 制 HSV- 体外增殖， 50 值均为 12. 5 μg / mL； 广东桑 7、 28、 的 94- 抗青 10、 抗逆 01- 翁抗 1 及白桑的英沙 3 等品种的桑叶乙酸乙酯萃取组分也表现出较强的抗 HSV- 活性， 50 值介于 12. 5 ～ 25 μg / mL 之间； 部分 1 IC 1 品种桑叶的正丁醇萃取组分也有一定的抗 HSV活性， 但活性较低（ 结果未列出） 。 2． 2． 2 多个品种的桑叶水相 组分及石油醚萃取组分能不同程度地抑制 Flu A / 抗 Flu A / E13 活性 “－ ” 当细胞 CPE 为“ ++ ” ； 细胞对照组无 CPE 记为 时所对应的样品浓度即为该样品对这种病毒的半数 抑制浓度 IC50 ； 如果两个相邻稀释度样品处理的细 “+++ ” “+ ” 则 IC50 值记为两个相 ， 和 胞 CPE 分别为 邻浓度范围（ 如 12. 5 ～ 25 μg / mL 等） 。 2 2． 1 结果与分析 供试桑品种的桑叶萃取组分抗病毒活性鉴定 对 20 个桑品种桑叶的 4 种组分 （ 包括石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇的萃取组分和水相组分 ） 进行抗 病毒活性检测， 结果如图 1 所示： 即使桑叶萃取组分 样品浓度为 100 μg / mL， 所有萃取组分及水相组分 但部分来源桑叶萃 都不能抑制 CVB3 的体外增殖， 1、 取组分样品分别对 HSV- Flu A / E13 和 DV2 显示 1 出不同程度的抗性活性。 其中： 能抑制 HSV- 的样 20 品最多， 个品种桑叶的乙酸乙酯和石油醚萃取组 分以及 13 个品种桑叶的正丁醇萃取组分均能有效 1， 抑制 HSV- 但所有供试品种桑叶的水相组分都对 HSV- 无抗性活性； 有 18 个品种桑叶的水相组分和 1 9 个品种桑叶的石油醚萃取组分表现出抗 Flu A / E13 的活性， 而桑叶的乙酸乙酯及正丁醇萃取组分 分别只有 2 个和 4 个桑 抗 Flu A / E13 的样品较少， 叶品种的桑叶样品显示出一定的抗性活性 ； 具有对 DV2 抑制活性的样品相对较少， 检测到 11 个品种桑 E13 的体外增殖 （ 表 1） 。 其中以广东桑品种 69 的 桑叶中这 2 种组分的活性最为明显， Flu A / E13 抗 7、 7、 的 IC50 值均为 12. 5 μg / mL； 其它如 94- 44- 抗青 10 以及翁抗 1 等广东桑品种桑叶的水相组分或石 油醚萃取组分也表现出较好的抗 Flu A / E13 的活 IC 性， 50 值均≤25 μg / mL。 只检测到少数品种桑叶 的乙酸乙酯和正丁醇萃取组分有抗 Flu A / E13 的活 性， 且活性较低（ 结果未列出） 。 2． 2． 3 抗 DV2 活性 广东桑、 鲁桑和中间型桑的 部分品种的桑叶萃取组分具有一定程度的体外抑制 DV2 增殖能力， 其活性成分主要存在于水相组分和 石油醚萃取组分中， 但活性一般， DV2 的 IC50 值 抗 均 ＞ 25 μg / mL（ 表 1） 。 只检测到少数品种桑叶的 图1 Fig． 1 20 个桑品种的桑叶萃取组分抗病毒活性的检测 Determination of antiviral activity of leaf extraction fractions from 20 mulberry varieties 乙酸乙酯和正丁醇萃取组分有抗 DV2 活性， 并且这 些品种桑叶中的这 2 种组分不具有抗 Flu A / E13 活 性（ 结果未列出） 。

 3 小结 分及剩余水相组分进行了抗病毒活性检测 ， 结果表 明不同桑品种的桑叶具有不同的抗病毒活性成分 。 1、 桑叶提取物中的不同萃取组分对 HSV- Flu A / E13 DV2 病毒具有不同程度的选择性抑制活性 ， 和 但对 本研究收集了分属不同桑种的 20 个桑品种的 桑叶， 用乙醇提取后再用不同溶剂萃取 ， 对各萃取组 956 蚕 业 科 学 2011； 37 （ 5） tandem mass spectrometric analysis of mulberry 1deoxynojirimycin in human plasma： application to pharmacokinetic studies〔J〕 Bios． 2008， 8） ： 2210 － 2213 72（ ci Biotechnol Biochem， CVB3 均不具有抗性作用。 可能受检测样品数量的 具有抗病毒活性的广东桑品种较其它桑种的 限制， 供试的 12 个广东桑品种桑叶的乙酸乙酯萃 品种多， 1 取组分和水相组分分别对 HSV- 和 Flu A / E13 显示 出抗性活性， 其中 69 和抗青 10 两个品种桑叶的不 同萃取组分对 3 种病毒都具有抑制作用。中间型桑 品种农桑 10 号也具有明显的广谱抗病毒活性 ， 能有 1、 效抑制 HSV- Flu A / E13 和 DV2 的体外增殖。 其 余大多数桑品种的桑叶萃取组分仅对某种病毒具有 抑制作用， 并且其抗性活性大小不一。 已有研究表 明， 桑叶中含有黄酮、 多糖、 脂类、 生物碱、 甾醇等成分 ， 其中桑叶生物碱 1脱氧野尻霉素 （ DNJ） 及其 ， 但桑叶中其它 成分的抗病毒活性尚缺乏系统和深入的研究 。 衍生物的抗病毒活性已有报道 根据本试验结果认为， 桑叶作为抗病毒药物或 功能食品均具有很高的研究和应用价值 。有关桑叶 提取物对其它病毒的抑制活性和抗病毒活性成分及 活性机制， 正在做进一步的研究。