蛋白桑：不同桑品种桑叶中的 3 种生物活性物质含量测定

摘 要 为了合理开发利用我国桑树资源的药用及保健功能，分别采用高效液相色谱法与比色法测定 15 个桑品种桑叶中的1-脱氧野尻霉素( DNJ) 、单宁酸和 γ-氨基丁酸含量。15 个桑品种的桑叶干物质中上述 3 种活性物质的质量比分别在 0. 672 0 ～1. 232 5、5. 098 3 ～ 9. 394 7、1. 480 6 ～ 3. 079 3 mg / g 之间，桑品种乐山花桑桑叶中的 DNJ 含量最高，百桑 775 桑叶中的单宁酸、γ-氨基丁酸含量最高。检测结果表明，桑叶中富含 DNJ 、单宁酸、γ-氨基丁酸 3 种生物活性成分，但不同桑品种桑叶中 3 种成分的含量存在极显著差异( P ＜0. 01) 。在桑树药用保健成分的产业化开发中，桑品种应作为原材料选择的一个重要因素。

关键词 桑叶; 1-脱氧野尻霉素; 单宁酸; γ-氨基丁酸; 桑品种

桑叶中含有多种功能活性成分，如黄酮类、多糖、超氧化物歧化酶( SOD) 、1-脱氧野尻霉素( 1-de-oxynojirimycin ，DNJ) 、单宁酸( tannic acid) 、γ-氨基丁酸( γ-aminobutyric acid ，GABA) 等。其中，DNJ 具有降血糖、降血脂、抗肿瘤等功效; 单宁酸具有抗菌、抗病毒及抗肿瘤活性; GABA 对哺乳动物的生长发育具有重要调节作用，还具有降血压、调节心律失常、调节激素分泌、健脑、控制哮喘、治疗癫痫、镇痛、抗焦虑及抗惊厥等功效。基于桑叶中所含 DNJ 、单宁酸、GABA 3 种生物活性物质的医药保健功能，本试验测定分析不同桑品种桑叶中这 3 种生物活性物质的含量，筛选适合开发提取桑叶 DNJ 、单宁酸、GABA 的桑品种，为生产桑叶医药保健品提供优质原料。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

供试的 15 个桑品种分别是云南 9 号、渝桑、伦教 40 号、桐选 1 号、实钴 21、105 新、育 151、百桑775、农桑 8 号、新剑持、乌皮桑、101-北一号、中桑5801、乐山花桑、胜利大叶。各品种的桑叶于 2012年 5 月中旬采摘于重庆市蚕业科学技术研究院桑园。采摘时间为上午 10:00 左右，采摘下部枝条第6 ～ 10 叶位的成熟桑叶。桑叶采摘后带回实验室用纯水冲洗干净，阴凉处晾干表面水分后，每个品种取500 g 桑叶用直接干燥法［11］将桑叶烘干，测算桑叶中的水分含量，然后将烘干的桑叶粉碎( 过 60 目) 后装袋密封，常温保存备用。

DNJ 、单宁酸标准品为北京德威钠生物技术有限公司产品; γ-氨基丁酸( GABA) 标准品、甘氨酸( Gly) 、9-芴基氯甲酸甲酯( FMOC-Cl) 、乙腈( 色谱纯) ，均为 Sigma 公司产品。

1.2 桑叶活性成分检测样品的制备

1.2.1 桑叶 DNJ 提取 精确称取桑叶粉 0. 5 g，加入 35 mL 纯水，80 ℃ 水浴浸提 2 h( 每 20 min 摇匀1 次) ，抽滤后用超纯水定容至 50 mL，即得桑叶 DNJ 样品提取液。

1.2.2 桑叶 GABA 提取 称取 0. 5 g 桑叶粉装入10 mL 的离心管中，加 2 mL 纯甲醇，室温振荡 15min ，5 000 r / min 离心 5 min，离心后的固体样品再加 2 mL 纯甲醇，5 000 r/min 离心 5 min，弃上清液，沉淀物于 70 ℃烘 30 min，使样品中的甲醇挥发，加5 mL 纯水，50 ℃ 振荡 2 h，5 000 r / min 离心 15 min，取上清定容至 20 mL，4 ℃保存备用。

1.2.3 桑叶单宁酸提取 称取桑叶粉 0. 5 g，加入70% 乙醇 10 mL，于 70 ℃ 条件下以功率为 160 W 的超声波提取 20 min，然后5 000 r/min 离心5 min，共提取 2 次，抽滤后用纯水定容至 50 mL 备用。

1.3 桑叶 DNJ 含量的测定

1.3.1 DNJ 标准液配制和标准曲线线性回归方程的建立 准确称取 20 mg DNJ 标准品于 25 mL 容量瓶中，加超纯水溶解并定容，即得 0. 8 g/L 的 DNJ 标准溶液，稀释至质量浓度为 60、120、180、240、300、480 μg / mL 备用。以 DNJ 的质量浓度为横坐标( x) ，吸光度为纵坐标( y) 绘制标准曲线，得 DNJ 的标准曲线线性回归方程为 y = 15 776x － 70 392，相关系数 r =0. 999 6，在 60 ～480 μg/mL 范围内吸光度与 DNJ 浓度呈良好的线性关系。

1.3.2 DNJ 衍生化 取 DNJ 提取液( 或 DNJ 标准液) 300 μL 于 5. 0 mL 的离心管中，加入 0. 4 mol/L硼酸钾缓冲液( pH 8. 5) 300 μL ，再加入 5 mmol/L的 FMOC-Cl ( 溶解于乙腈中) 600 μL ，混匀后于25 ℃ 水浴 20 min。加入 1 mol / L 甘氨酸 300 μL 中和剩余的 FMOC-Cl 以终止反应，加入 1% 醋酸 300μL 及超纯水 1 200 μL ，8 000 r/min 离心 20 min，以0. 45 μm 微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液备测。空白对照以蒸馏水代替 DNJ 提取液进行衍生化反应。

1.3.3 样品测定 采用高效液相色谱 ( HPLC)法测定。色谱条件: 色谱柱 C18柱( 150 mm ×4. 6 mm × 5 μm) ; 荧光检测器激发波长 254 nm，发射波长 322 nm; 流动相为乙腈-0. 1% 醋酸( 体积比50 ∶ 50) ; 流速 1. 0 mL / min; 柱温 25 ℃ ; 进样量 10μL 。每个样品均重复测定 6 次，取平均值。

1.4 桑叶 GABA 含量的测定

1.4.1 GABA 标准液配制和标准曲线线性回归方程的建立 准确称量 GABA 500. 0 mg 标准品于100mL 容量瓶中，用超纯水溶解，定容，即得 5. 00 mg / mL的标准溶液，并准确配制为 0、0. 10、0. 25、0. 30、0. 50、0. 75、1. 00 mg / mL 的 GABA 系列标准溶液。脱色处理: 取 7 支干燥洁净试管，按顺序分别吸取上述浓度的 GABA 系列标准溶液 1 mL ，加入 2 mol/LAlCl3溶液 50 μL ，室温振荡 15 min，12 000 r/min 离心5 min，取0. 5 mL 上清液，加入1 mol/L KOH 溶液300 μL ，室温振荡 5 min，12 000 r / min 离心 5 min，待用。取经过脱色处理的 0. 3 mL GABA 标准品溶液，加 0. 2 mol/L 四硼酸钠缓冲液( pH 10. 0) 0. 5 mL 、6% 苯酚 0. 4 mL，涡旋混匀，再加 0. 6 mL 纯 NaClO 溶液( 活性氯≥5%) ，涡旋混匀，放置 15 min，待溶液出现蓝绿色后，加入 60% 乙醇溶液 2. 0 mL，用分光光度计测定 D( 645 nm) 值。以 GABA 质量浓度为横坐标( x) ，吸光度为纵坐标( y) 绘制标准曲线，得回归方程为 y =0. 731 3x －0. 000 6，相关系数 r =0. 999 8，在 100 ～ 1 000 μg / mL 范围内吸光度与GABA 浓度呈良好的线性关系。

1.4.2 样品测定 采用比色法测定。取 1 mL样品溶液，按上述方法脱色处理后进行测定。每个样品均重复测定 6 次，取平均值。

1.5 桑叶单宁酸含量的测定

1.5.1 单宁酸标准液配制和标准曲线线性回归方程的建立 准确配制 0. 100 mg/mL 的单宁酸标准溶液，分别吸取 0、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 mL 标准液加入装有 25 mL 纯水的 50 mL 容量瓶中，再加入2. 5 mL Folin-Denis 显色剂，之后 30 s ～ 8 min 内加入10 mL 饱和 Na2CO3溶液，摇匀后加纯水定容至50mL ，静置 30 min。以不加单宁酸标准液的反应体系作参比，用分光光度计测定 D( 750 nm) 值，每个样品做 3 次平行测定。以平均吸光度值与标准溶液的浓度作线性回归分析，得回归方程为 y =1. 798 7x +0. 004 2，相关系数 r = 0. 999 7，在 50 ～ 250 μg / mL范围内吸光度与单宁酸浓度呈良好的线性关系。

1.5.2 样品测定 采用比色法测定。吸取待测样品 1 mL，加入装有 25 mL 纯水的 50 mL 容量瓶中，加入 2. 5 mL Folin-Denis 显色剂，30 s ～ 8 min 内再加入 10 mL 饱和 Na2CO3溶液，摇匀，用纯水定容至50 mL，30 min 后，用纯水作空白测定 D ( 750 nm)值。每个样品均重复测定 6 次，取平均值。

1.6 数据统计分析

检测数据用软件 Excel 和 Spss16 进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同桑品种桑叶中的 DNJ 含量比较

DNJ 标准品和桑叶 DNJ 提取液经衍生化后在高效液相色谱仪进行测定，得到色谱图如图 1 所示。DNJ 标准品的色谱图中包括 9-芴基氯甲酸甲酯( FMOC-Cl) 和 DNJ 的衍生物 DNJ-FMOC ，9-芴基氯甲酸甲酯和甘氨酸( Gly) 的衍生物 Gly-FMOC ，以及9-芴甲醇( FMOC-OH) 共 3 个色谱峰，在本试验条件下，DNJ-FMOC 的保留时间为 2. 731 min。由色谱图

可以看出，衍生化后的 DNJ 与 Gly-FMOC 、FMOC-OH 的峰间距分别相差 2. 719 min 和 4. 243 min，这 2 种物质均不会干扰 DNJ 的测定。

15 个桑品种桑叶干物质中的 DNJ 质量比在0. 672 0 ～ 1. 232 5 mg / g 之间( 表 1) 。其中，桑品种乐山花桑桑叶中的 DNJ 含量最高，其次是胜利大叶，新剑持桑叶中的 DNJ 含量最低。在 α =0. 05 水平下，乐山花桑桑叶中的 DNJ 含量除与胜利大叶桑叶中的 DNJ 含量无显著差异外，均极显著高于其它供试桑品种，说明不同桑品种桑叶中 DNJ 含量存在极显著差异( P ＜0. 01) 。乐山花桑和胜利大叶桑叶中的 DNJ 含量分别是新剑持的 1. 83、1. 80 倍，可作为桑叶 DNJ 食品或药品开发的候选桑品种。

刘凡等测定采自广州蚕区桑园的 98 个桑品种桑叶的 DNJ 含量，其中大多数品种干物质中的DNJ 质量比在 0. 1 ～ 1. 000 mg / g 之间，与本试验的测定结果有一定差异，分析原因可能是供试桑品种和桑叶样品的采摘时间及采摘部位的差异所致。

2.2 不同桑品种桑叶中的单宁酸含量比较

由表 1 可知，15 个桑品种桑叶干物质中的单宁酸质量比在 5. 098 3 ～9. 394 7 mg/g 之间。其中，桑品种百桑 775 桑叶中的单宁酸含量最高，而育 151桑叶中的单宁酸含量最低。在 α =0. 05 和 α =0. 01水平下，桑品种百桑 775、101-北一号、105 新、中桑5801、实钴 21 桑叶中的单宁酸含量无显著性差异，但均极显著高于其它桑品种。15 个桑品种桑叶干物质中单宁酸的平均质量比为 7. 065 7 mg/g，百桑775 桑叶中的单宁酸含量是育 151 的 1. 84 倍，说明不同桑品种桑叶中的单宁酸含量存在极显著差异( P ＜0. 01) 。

2.3 不同桑品种桑叶中的 GABA 含量比较

由表 1 可知，15 个桑品种桑叶干物质中的GABA 质量比在 1. 480 6 ～ 3. 079 3 mg / g 之间。其中，百桑 775 桑叶中的 GABA 含量最高，质量比为3. 079 3 mg / g，中桑 5801 桑叶中的 GABA 含量最低，质量比为 1. 480 6 mg/g，二者相差 2. 08 倍。在α = 0. 05 和 α = 0. 01 水平下，百桑 775 与其它桑品种桑叶中的 GABA 含量的差异均达极显著水平，说明不同桑品种桑叶中的 GABA 含量存在极显著差异( P ＜0. 01) 。

3 讨论

目前测定 DNJ 的主要方法是高效液相色谱法，其它方法如气相色谱法、分光光度法等也可以用于DNJ 含量的测定，但采用 HPLC 法测定具有灵敏度高的特点; 单宁酸的测定运用较多的是比色法;GABA 的测定方法有比色法、放射受体法、薄层扫描法、高效液相色谱法、氨基酸分析仪和气相色谱-质谱联用法，其中比色法因为操作简便较为常用，但其缺点是植物叶片中含有大量的色素，会严重干扰比色反应，因此，本试验用 AlCl3有效地去除桑叶中的水溶性色素后，采用分光光度法就可以准确测定桑叶中的 GABA 含量。

本试验测定 15 个桑品种桑叶样品中的 DNJ 、单宁酸、GABA 含量，抽取 3 种活性物质的检测样品加入 3 种不同浓度的标准溶液( 加入的标准品含量为检测样品中 DNJ 、单宁酸、GABA 含量的 0. 5、1、1. 5倍) ，对 3 种物质的提取方法进行加标回收试验。其中，DNJ 加标回收试验的平均回收率为 98. 15%;单宁酸加标回收试验的平均回收率为 97. 90%;GABA 加标回收试验的平均回收率为 96. 84% 。因此认为，本试验对桑树中 3 种活性物质的提取方法具有较高的准确度。供试的 15 个桑品种的桑叶干物质中，DNJ 的质量比在 0. 672 0 ～1. 232 5 mg/g 范围，平均质量比为0. 917 2 mg / g，含量最高的桑品种是乐山花桑; 单宁酸的质量比在 5. 098 3 ～9. 394 7 mg/g 范围，平均质量比为 7. 065 7 mg/g，含量最高的品种是百桑 775;GABA 的质量比在 1. 480 6 ～ 3. 079 3 mg / g 之间，平均质量比为 2. 149 2 mg/g，与金丰秋等所测桑叶干物质中的 GABA 平均质量比为 2. 26 的结果基本一致。夏玉玲等和冀宪领等的研究也表明桑叶含有丰富的 GABA 及其前体物质谷氨酸。15 个桑品种桑叶中 DNJ 、单宁酸、GABA 含量的差异最高分别达到 1. 83、1. 84、2. 08 倍，3 种活性成分在不同桑品种桑叶中的含量存在极显著差异。因此，在桑树药用保健成分的产业化开发中，桑品种应作为原材料选择的一个重要因素，乐山花桑和百桑 775 可作为桑叶 DNJ 、单宁酸、GABA 药品及保健品开发的专用桑品种。