蛋白桑：桑叶总黄酮提取及纯化工艺研究

摘 要 桑叶是桑科植物桑的干燥叶，在我国大部分地区都有分布。现代研究表明，桑叶具有降血糖、延年益寿、清除氧自由基、抗炎、抗过敏、防癌、抗癌等作用。桑叶中的有效成分之一黄酮类化合物有着重要的生理活性，它具有很高的保健功能和药用价值，其提取及功能性的研究受到世界各国的普遍关注。本试验以提取纯化高品质的桑叶总黄酮为主要研究目的，力图寻找更经济的提取纯化方法，使之易于工业化生产。 自由基是生物体中生化反应的普遍中间介质。当人体内自由基产生过多或清除过慢，就会引发多种疾病，故筛选天然抗氧化剂成为当前国内外研究的热点。由于黄酮类化合物多具有抗氧化活性，因此，本论文对桑叶总黄酮清除自由基的作用也作了初步探讨。 具体工作如下: 1、以芦丁为标准品，利用差示分光光度法，建立桑叶总黄酮的测定方法，对桑叶中黄酮类化合物的浸提工艺条件进行筛选。在单因素考察的基础上，通过四因素三水平的正交试验得出桑叶中黄酮类化合物的最佳提取工艺条件为:在80℃下，用75%的乙醇，料液比为1:15，浸提2次，每次提取1h，测得总黄酮得率最高。 2、利用大孔吸附树脂对桑叶中黄酮类物质的纯化方法进行了研究。最终选用D101大孔吸附树脂对桑叶总黄酮进行分离，并得到了最佳精制条件:吸附原液pH值3.O，盐度(NaCl含量)2%，吸附流速5ml/min，洗脱剂浓度为45%乙醇溶液，洗脱剂用量为4BY。该法具有所选溶剂安全无毒;分离材料可再生;所得产品纯度高等优点。 3、利用紫外光谱法分别研究了桑叶总黄酮在体外对1，卜二苯基一2一苦肼基自由基(DPPH·)、超氧自由基和羟基自由基的清除作用。结果表明，桑叶总黄酮对DPPH·、羟基自由基和超氧自由基都有清除作用。 关键词:桑叶总黄酮;提取;纯化;抗氧化活性 

 第一章 前言 弟一草 日u 吾 桑叶异名铁扇子，为桑科属(Morus L.)的树叶。本属植物全球约有16种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区，有许多种(Species)及变种(Variety)。根据国内外植物学家的文献记载，近年来，各省区开展了桑品种资源的考察，收集到大量的实物表明，我国是世界上桑种最多的国家，约有11种，分布于全国大部分地区，以江苏、浙江等南方养蚕地区产量较大。其中栽培种有鲁桑，白桑，广东桑，山桑，瑞桑等，野生种有长穗桑，长果桑，黑桑，华桑，蒙桑，川桑，鸡桑等¨。1.I桑叶有效成分的研究进展 自古以来，桑n十主要作为养蚕和禽畜的主要饲料，营养丰富。其实，桑叶也是一种很好的中药。桑叶中含有丰富的蛋白质、糖类化台物、生物碱、微量元素、维生素、黄酮及黄酮苷类、甾类、氨基酸类、挥发油(有机酸、酚类)[31等成分，具有极高的营养价值和药用价值。桑叶最早记载于《神农本草经》，桑叶性味苦甘、寒，甘所以益血，寒所以凉血:甘寒相合，故下气而益阴，又能止咳，是中医清热解毒之要药。主治风热感冒，肺热燥咳，头晕头疼，目赤晕花等症。《本草撮要》:“一之代茶，取经霜者，长服IE汗。”桑叶有长发之妙用。《千妙方》:“治头发不长，桑叶，麻叶，煮泔水淋之，七次，可长数尺。”《本草纲目》:“桑叶乃手足阳明之药，汁煎代茗，能止消渴，明目氏发。”这些记载充分说明我国古代就有对桑叶药用价值的研究。有人称桑树为延年益寿的圣树。由于桑叶有极高的药食两用价值，所以引起了现代科研人员的极大兴趣，并对它进行了详细的研究和报道。 根据相关专家分析:在今后一段时期内，桑叶保健食品将具有广阔的市场。日本一些科研人员认为，桑叶有可能成为功能性食品和原料。目前日本市场上已有桑叶面及含桑叶的小脆饼，我国研制开发了桑叶保健品种和功能性饮料，如桑叶速溶茶、桑叶八宝茶、桑叶粉、桑叶晶、桑叶保健酒、桑叶口服液、桑叶珍珠粉蜜、桑叶可乐、桑叶花粉蜜、桑叶汽水、桑叶面、桑叶糕点及桑叶膨化小食品等，从而增加了桑叶保健品和饮料的新品种，这就在一定程度上解决了胃病和失眠症患者不宜饮茶的问题，也满足了不同消费层次的需要。桑叶饮料是中老年人及不宜饮茶者的一种新型饮品，在饮茶过程中会得到一定的保健效果，有利于养神保健，延年益寿。桑叶在食品方面的开发利用逐渐受到人们的重视，随着科技的进一步发展，挖掘桑叶资源的潜力己成为今后发展的趋势:桑叶可以作为食品、药品、 桑叶总黄酮提取段纯化工艺研究化妆品等原料，今后发展的重点是对桑叶有效成分的分离、提取、纯化、，还有就是对治疗糖尿病、高血压、癌症与艾滋病的研究也会成为热点。 现代医学的进一步研究证实了桑叶的药用与保健价值。据分析测定，桑叶中含有多酚类、黄酮类、糖类、脂肪、18种氨基酸、胆酸、有机酸、异槲皮甙，胡萝 h素、Vbl、Vb2、Vc、叶酸和钾、钙、磷、铁、锰营养元素，以及铜、锌等人体所需的微量元素。中国农业科学院蚕研所对桑叶的营养及保健作用测定分析表明:桑叶中含有水分75 22%、粗碳水化合物16.92%，这些成分有利于减肥和消除脚气、水肿、盗汗。浙江医科大学药理实验室也表明:桑叶具有稳定神经系统功能的作用，减少或消除积滞在肌肤或内脏中的脂褐质，从而延长机体的寿命。l 1.1桑叶黄酮 通过对桑叶成分的分析可知，桑叶醇提物中总黄酮含量较高，约占3.3%叫，是植物叶中含黄酮较多的一种，主要包括芸香甙(Rutin)，槲皮素(quereetin)，异槲皮索(isoquercitin)，韩国学者Kim等122】从桑叶中分离到几种黄酮，分别为缚班萨一3.氧.B-D一吡喃葡萄糖苷(紫云英菅)、堪菲日乒3.氧.(6".氧一乙酰基).B-D.吡哺葡萄糖苷、槲皮素.3.氧.(6"-氧.乙酰基)一f3-D一吡喃葡萄糖苷(芦丁)、槲皮素.3一氧.B.D.毗喃葡萄糖苷、槲皮素.3一氧_a.D.吡喃葡萄糖基一B.L.鼠李吡哺糖基一B.D.吡喃葡糖苷、槲皮素.3.氧.B.D.吡喃葡萄糖苷、槲皮素.3，7.二.氧一B.D一吡喃葡萄糖苷和槲皮素。金丰秋【23J报道，每100mg干桑叶中含异槲皮苷200--500mg，槲皮苷30mg，槲皮苦素lOOmg，部分结构见图2。1.1.2桑叶多糖 赵俊㈣等采用水提法提取桑叶中的多糖物质，产量为2.58949/1009桑叶。张传蕙等用制备法测定鲜桑叶的多糖含量，达到2.55%，并对其化学成分进行了定性测定。欧阳臻等提取桑叶中的多糖物质并进一步纯化得MPll、MPl2、Mpl3三个多糖组分，用气相色谱分析得知MPll由R.ha、Ara、Xyl、Man、Glu、Gal组成，其比例为21:16:3:3:1:20:MPl2由Rha和Glu组成，其比例为3:l;MPl3主要由Rha组成。张琳华口61等比较稀酸、稀碱、蒸馏水3种提取方法，采用L9(34)正交试验，优选出最佳提取条件。并进一步进行了纯化。Asano等已从桑叶中分离出6种N一糖化合物，并确定其结构。 

第一章 前言 图1部分黄酮类化合物的结构 1.1.3桑叶生物碱 桑叶中含有丰富的生物碱，其中1.脱氧野尻霉素(DNJ)是一种非常重要的生物碱，DNJ是一种哌啶生物碱，其化学名称是3，4，5-三羟基.2一羟甲基四氢吡啶，是t-deoxynojirimycin的缩写‘2 81。DNJ的化学分子式为C6H13N04.分子量163t291。DNJ首先由M.Yagi等从桑根皮中分离得到并定名为“moranoline”。这是DNJ作为天然产物首先被分离。Yoshiaki Yoshikuni从桑中分离出了DNJ/301。Asano[31I等通过改变DNJ的提取和纯化条件，从桑叶中分离出多种多羟基生物碱，包括DNJ、N一甲基.DNJ、2-氧一0一D.半乳吡喃糖苷一I-DNJ、fagomine、l，4一二脱氧一1，4一亚氨基一D一阿拉伯糖醇、l，4一二脱氧.1，4-亚氨基.(2.氧.吡哺葡萄糖糖苷)一D一阿拉伯糖醇和1 Ⅱ，2 B，3 El，4 B.四羟基.去甲莨烷等七种生物碱。桑叶中DNJ含量为o.1I%132J。桑根中DNJ含量为o.14%。11.4桑叶中其它成分 黄酮、多糖和生物碱为桑叶的主要成分，据分析测定，桑叶还含有蛋白质、17科，氨基酸、多酚类、维生素和钾、钙、磷、铁、锰等营养元素，以及铜、锌等人体所需的微量元素。 桑叶中，粗蛋白含量约为20%--27%。桑叶中的神经传递物质、降血压物质Y一氨基丁酸(GABA)(又称Y一氨酪酸)口的含量达到226mg/1009干叶。日本野田信三等对干桑叶中氨基酸含量进行了测定:还测定桑叶中维生素含量为视黄醛O.67mg/1009、胡萝h素0.67mg/1009、Vbl0.59mg/1009、Vb20.59mg/1009、Vppl.35mg/1009、Vc3 1.6mg/1009。张传惠口”对新鲜桑叶中氨基酸、维生素C含量分别进行了测定，每1009鲜桑叶含维生素C 65mg。测定结果表明;桑叶含多种维生素，其含量不逊于鲜茶口…。对桑叶甾醇的研究发现1009桑叶中有谷甾醇46mg、 桑叶总黄酮提取及纯化工艺研究 豆铺醇3mg，其谷甾醇含量比绿茶(每1009含甾醇13rag)高3~4倍。 1.2桑叶化学成分药理作用及应用研究概况 1.2.1黄酮类物质药理作用及应用研究概况 黄酮类物质主要指以2一苯基色原酮为基核的一类化合物∞38】(如图2)，以游 图2黄酮类化合物的基本结构离的苷元或以与糖结合的苷类等形式存在于很多植物中p”。它能抑制脂肪氧化，作为金属离子络合剂抑制油脂的自动氧化14叫，还有研究表明柑橘中黄酮类物质能抑制15一脂肪氧化酶，从而抑制了由它催化的脂类氧化过程。它具有抗癌特性，黄酮类的抗氰化特性以及吸收紫外线的能力、使得它们在癌变的各个阶段发挥作用:DNA损伤(起使阶段)、肿瘤生长(生长阶段)和细胞扩散(增值阶段)。具有治疗心血管疾病的作用，现代许多治疗这类疾病的药物都是基于黄酮类物质，如橙皮苷和 4芦丁。防止毛细血管脆性，抑制血小板聚集，抗炎、抗过敏、镇痛。黄酮类物质在食品工业中应用，主要是作为天然甜味剂。糖基化的黄烷酮很容易转化成相应的二氢查耳酮，起甜度是蔗糖的loo~1000倍，并且具有低热量，适合糖尿病和肥胖人群。它是食品天然抗氧化剂，利用其清除自由基的能力和酚基的抗氧化特性，常被用做食品的抗氧化剂，并具有保健作用。它是天然色素，多成黄色，既有水溶性的，也有脂溶性的，可作为食品着色剂，同时具有保健功效。黄酮类拥有许多单体，它含有槲皮素，异槲皮苷，槲皮苦素，芦丁等一些具有经济价值及药用价值的物质。槲皮素是~种天然的黄酮化合物。广泛分布于蔬菜、水果、饮料及中草药之中，具有扩张冠状动脉、降血脂、抗炎、抗过敏，抗糖尿病并发症等多种药理作用。1971年NCI首次发现槲皮素对P388白血病有抑制作用。近年来已经发现槲皮素对肿瘤具有预防及治疗作用。特别作为化学预防，能全面的作用于癌发生的始发、促癌和演进三个阶段，兼有抗癌和诱导分化的作用而备受人们关注。芦丁具有较好的祛痰，止咳作用，并有~定的平喘作用，此外，还有降血压，增强毛细管抵抗力，减少毛细管脆性等作用。1.2，2 1.脱氧野尻霉素药理作用及应用研究概况 4 第一章 前言 1.脱氧野尻霉素(DNJ)是桑叶独有的生物碱，DNJ是一种糖苷酶掏剂，能阻碍 糖苷酶的活性。据试验，当对老鼠投口服葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉后，老鼠的血糖值急剧上升，食后30min达到最高值。若同时投入DNJ，则可推迟达到最高值 的时间，且最高值也较原先低。因为DNJ与小肠内各种糖苷酶的亲和性比葡萄糖、麦芽糖等物质的亲和性强，由于竞争拮抗，阻碍了糖苷酶与碳水化合物结合，从而 降低血糖。目前DNJ及其衍生物已作为糖尿病人的药品。另外，据各国研究资料表 明，DNJ及其衍生物结构类似于葡萄糖并于糖类化台物相干扰，可阻止糖分子附加到人体免疫缺陷病毒HIV外层，阻止HIV在人体细胞上的生存，从而使HIV对人体的侵袭无效。因此DNJ及其衍生物可作为一种潜在的医治爱滋病的药物。I 2-3 Y.氨基丁酸药理作用及应用研究概况 Y.氨基丁酸(GABA)是一种天然活性成分，广泛分布与动植物体内，是由谷氨酸转化而来的，参与多种代谢活动，是一种神经传导介质。其作用是降低神经元活性，防止神经细胞过热。GABA能结合抗焦虑的脑受体并使之激活，然后与另外~些物质协同作用，阻止与焦虑帽关的信息抵达脑指示中枢，因此，GABA可从根本上镇静神经，从而起到抗焦虑的效果㈣。此外，GABA还具有降血压作用，其主要作用机制是通过调节中枢神经系统达到降压效果，GABA能作用于与脊髓的血管运动中枢，有效促进血管扩张，达到降低血压的目的。据报道，黄芪等中药的有效降压成分即为GABA。医学上，GABA对脑血管障碍引起的症状，如偏瘫、记忆障碍、儿童智力发育迟缓及精神幼稚症等有很好的疗效口“。最新的研究表明，GABA除具有降f『『L压等作用外，还有精神安定，肾机能和肝机能改善作用，促进酒精代谢作用和高效减肥等活动。神经生理及神经医学的研究表明，GABA是一种重要得活性物质，在人脑中，虽然GABA可由脑部的谷氨酸在专一性较强的谷氨酸脱羧酶作用转化而成14≯50J，但随着年龄的增长和精神压力的加大使GABA的积累异常困难。目fii『已经广泛地应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味料等制品中。另外还有报道，应用生物技术制造的高GABA饮料以及利用乳酸菌等制作的富含GABA的食品配料，均可直接作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。在我国，有关GABA食品的研究开发报道较少，增加了进一步研究的空IN[1l。

1.2.4多酚类物质药理作用及应用研究概况 多酚泛指一类性质各异的多羟基酚衍生而成的复杂的有机混和物，具有活泼的羟基氧，能在多酚氧化酶作用下终止生物体内自由基的连锁反应，起到清除自由基和消除自由基毒性的作用。杨贤强口6J等用荧光法测定了茶的多酚实验组和对照 桑叶总黄酮提耻及纯化]=艺酬究组小鼠心肌脂褐素水平，以每克组织中所含的微克数表示。结果表明，多酚使小鼠心肌内的脂褐素由对照组的4.4+1.2%组织降为2.09+0.29%组织，下降率为52%。结果表明，多酚不仅具有消除自由基和抑制肌体内脂质过氧化作用或延缓细胞脂褐素的产生，而且能提高体内抗自由基损伤的酶系SOD和GSH.PX等活力，因而具有延缓细胞衰老的作用。前苏联学者通过动物实验引入放射性Sr90使大白鼠发生放射病，经定期喂养多酚后，给药组存活，不喂给多酚的对照组则死亡。实验结果表明多酚类物质具有抗辐射作用。现代茶叶药理学研究表明，茶叶具有预防癌症的功效。根据Oguni I等对日本冈县中西部区各死亡率的调查发现，该地区胃癌和其他癌的SMR(标准化的死亡率)显著较全国平均值低，而该地区主要生产和饮用绿茶。进一步发现，绿茶的这种抑癌作用与绿茶中富含茶多酚物质有关。给腹水型肿瘤小鼠和肉瘤(Sarcoma 180)小鼠喂饲茶多酚，多酚对这两种肿瘤均有明显的抑制作用。日本专家发现，绿茶中的茶多酚对病毒作用于RNA所产生的化学反应具有相当强的阻断作用，其阻断能力高于目前国际上通用的治疗爱滋病药物AZT20~30倍。因此，多酚类物质具有抗衰老、抗辐射、消除自由基、防止肿瘤及增加机体免疫力等多种功能f57 58-”。1.2 5植物甾醇药理作用及应用研究概况 植物甾醇能降低血糖值，促进人体蛋白质合成，并能有效地掏肠道对胆固醇的吸收。植物甾醇对人体具有较强的抗炎作用促进胆固醇的降解代谢、对人体具有重要的生理活性作用，临床使用汪明有一定降脂作用。能预防和治疗冠心动脉粥样硬化类的一tS，脏病，对治疗溃疡、皮肤鳞癌、宫颈癌等也有明显疗效。植物甾醇乳化性能好而且稳定，可作皮肤营养剂应用于化妆品，并具有生发、养发之功效。

1.3选题意义 尽管中草药在我国已经有很久远的历史，但是直到二十世纪二十年代它才‘真正从本草学进入到药理学阶段。随着列中草药的深入研究，人们发现中草药中真正治病的是它所含有的有效成分，但是中草药的成分除了有效成分外，还有无效成分，杂质，甚至是一些有害成分，如何提高有效成分的提取，除去不需要的成分，成为中草药工作者关注的焦点。 近年来，有关桑叶及其有效成分已成为重要的研究项目，在桑叶多糖的提取及药理活性上已有所进展，但是对桑叶总黄酮的研究报道还不多见，许多研究表明黄酮类化合物具有多种生物活性，除利用其抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解 6 第一章 前言毒、镇静、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪氧化酶等方面也有显著效果。它是大多数氧自由基的清除剂，因而能提高SOD(过氧化物歧化酶)的活力，减少MDA(脂质过氧化物丙二醛)及OX-LDL(氧化低密度脂蛋白)的生成。它可以增加冠脉流量，对实验性心肌梗塞有对抗作用，对急性心肌缺血有保护作用，对治疗冠心病、心绞痛、高血压等有显著效果，对降低舒张压，防治心律失常、心血管病和活血化瘀也起重要作用。由于黄酮类化合物的这些生物活性使它的研究进入了一个新的阶段，掀起了黄酮类化合物研究、开发利用热潮，促使其在化妆品、医药、食品等工业中有广泛应用[611。但是对桑叫‘总黄酮的研究报道还不多见，国外有人对桑叶总黄酮进行了分离提纯，并得到了单体的纯品，而且进行了抗氧化活性的研究，得到了较好的结果，显示出桑叶总黄酮研究的巨大价值。但其提取工艺较苛刻，仅适用于实验室研究，不利于规模生产，这也使得桑叶黄酮类化合物在降血糖、降血脂、降低血清胆固醇、抗衰老、增强机体免疫力方面的活性研究受到限制。 自由基是生物体中生化反应的普遍中间介质。在正常生理情况下自由基的产生与清除可持续在一个有利无害的极低水平，但在衰老、应激、疾病的情况下却发生自由基对重要生物分子的损伤。现代医学研究表明:自由基被认为是人体衰老和某些慢性病发生的原因之一。当人体内的自由基产生过多或清除过慢，就会攻击各种细胞、器官并使之受到损害，加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。因此，需要一些抗氧化剂以清除多余的自由基。 在崇尚自然、回归自然的要求下，由于人们对生活质量要求的提高和对食品安全意识的要求增强，鉴于化学合成的抗氧化剂都稍有毒性，于是要求开发和利用天然的抗氧化剂的愿望日益迫切。有鉴于此，近二十年来天然的食品添加剂有了蓬勃的发展，从单纯作为油脂和含脂食品的抗氧化剂，发展到作为体内氧自由基的清除剂，咀达到保护人体细胞组织，保护心脑血管循环系统、抗癌及延缓衰老等生理作用。天然的抗氧化剂绝大部分都是多酚类物质，即都具有若干个羟基的苯环结构，而桑叶中的有效成分之~桑叶黄酮是多酚类物质且据文献报道，桑叶中有效成分有抗衰老作用。因此，我们研究桑叶总黄酮对自由基的清除作用是很有意义的。 桑叶总黄酮提取及纯化工艺研究 第二章 桑叶总黄酮提取工艺研究 桑叶是常用中草药之一，桑叶中含有芸香苷、懈皮素、异棵皮素、二氢山茶等黄酮类化合物，含量约占干叶重的1.0%~3.0%，是植物茎叶中黄酮类化合物含量较高的一种砸21。据有关文献资料报导，黄酮类化合物具有捕获自由基的作用，对生物体内在需氧.

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