应用RNAscope®进行测序后验证-中国研究团队文章解读

近年来，RNA-seq 以及 single cell RNA-seq 技术越来越多地被运用于多个研究领域，发现并揭示在特定组织细胞类型、生物学过程以及疾病发生发展中的标志性基因和基因表达调控机制。RNAscope® 技术具有高特异性，高灵敏度，可重复性好，多靶点同时检测的特点。作为RNA-seq 数据原位验证的“当红炸子鸡”，已从美国硅谷的出生地悄悄走进了中国各大科研机构和药企。

本文以 NIBS（北京生命科学研究所）陈婷教授团队和北京大学汤富酬团队、南方医科大学赵小阳教授团队在Cell Stem Cell期刊上发表的文章《Hoxc-Dependent Mesenchymal Niche Heterogeneity Drives Regional Hair Follicle Regeneration》《Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis》为例，解读RNAscope®技术在测序后验证方面的应用。

来自于NIBS的陈婷教授实验室专注于上皮组织干细胞并运用小鼠模型研究相关的问题。在2018年8月发表的“Hoxc-Dependent Mesenchymal Niche Heterogeneity Drives Regional Hair Follicle Regeneration”一文中，陈婷教授课题组运用小鼠模型，研究了间质微环境对毛囊再生的影响。

皮肤不同区域的毛囊具有不同的再生能力，如耳部皮肤毛囊的再生能力弱而背部皮肤毛囊的再生能力强。Koala突变小鼠和Eh突变小鼠的耳部皮肤毛囊再生能力增强。

作者利用FACS分离获得WT/Koa小鼠耳部皮肤、Wt/Wt小鼠耳部皮肤和Wt/Wt小鼠背部皮肤的表皮细胞和真皮细胞，并利用RNA-seq主要分析了在WT/Koa小鼠耳部皮肤和Wt/Wt小鼠背部皮肤中高表达的基因，发现有332个在表皮中高表达的基因、309个在真皮中高表达的基因，并根据这些基因在15号染色体上与Koa基因的距离进一步缩窄范围，筛选出Hoxc4-6，Hoxc8，Hoxc9作为后续研究重点。

由于RNA-seq使用的细胞为真皮或表皮的细胞混合群体，作者使用RNAscope®技术原位检测Hoxc基因在真皮和表皮中具体由什么细胞表达。结果发现Hoxc4、Hoxc6和Hoxc8在WT/Koa小鼠耳部皮肤和Wt/Wt小鼠背部皮肤的真皮乳头细胞中高表达，而在Wt/Wt小鼠耳部皮肤则几乎没有表达。而且真皮乳头细胞的Hoxc基因的表达是区域特异性而不是毛发周期依赖性（图B）。

真皮成纤维细胞也表达Hoxc4、Hoxc6和Hoxc8。而且不同皮肤区域的Hoxc基因在真皮乳头的表达水平高低与该区域毛囊干细胞的再生能力正相关。在此基础上，作者对Hoxc基因的功能、上下游调控进行了细致的研究。

她们发现，Hoxc基因在该过程中起着非常重要的作用。过表达Hoxc基因就足以重编程间充质真皮乳头细胞，改变上皮干细胞的再生潜能。Hoxc基因的区域局部性表达主要受到表观遗传状态的调控。通过Bmi敲除而减少Hoxc基因的表观遗传抑制状态或者诱导Hoxc基因与表观遗传活性区域的以为相互作用，扰乱Hoxc基因的区域特异性表达模式，可以引起毛囊再生。作者进一步研究表明，单一的Hoxc基因可以通过经典Wnt信号通路，激活处于休眠状态的真皮乳头微环境、促进毛囊再生。

南方医科大学的赵小阳团队与北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心、生命科学学院BIOPIC中心汤富酬团队、北医三院乔杰团队的合作文章，在2018年10月发表了“Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis”一文，通过对2854个睾丸细胞的单细胞RNA-seq技术，分析揭示了人类精子发生过程中的精原细胞、精母细胞和精子的顺序和逐步发育的关键生物学特征，并在非梗阻性无精症患者中鉴定出改变的RNA表达谱，提示单细胞RNA-seq技术在临床诊断和研究男性不育的潜在机制的巨大价值。

作者从8名自愿者中，通过随机挑选和流式分选的方式，获得了3059个单细胞，在此基础上，对其中通过质控的2854个睾丸细胞进行了单细胞RNA-seq测序。通过生物信息学分析，这些细胞可以分成17种细胞群体，其中14个细胞群体是从精原细胞、精母细胞到精子的生殖细胞，另外3个群体分别则是Sertoli细胞、小管周围肌样细胞与Leydig细胞和睾丸巨噬细胞。

在精原细胞、精母细胞到精子的逐级发育过程中，单细胞RNA-seq数据发现每一个阶段的细胞群都有各自特异性的基因表达，可用相对少的基因去区分开不同的细胞群。作者使用了RNAscope®技术去验证单细胞RNA-seq数据。比如，在HMGA1在精原干细胞、SCML1在L1细线期精母细胞、CCDC112在粗线期、TEX29在S1精子细胞表达。

在进一步对精原细胞分化发育过程的分析时，作者关注了信号通路的作用。作者发现，除了经典的RET信号通路外，BMP和FGF信号通路也很可能在精原干细胞的自我更新过程中有关键作用，其中BMPR1B和FGFR3在精原干细胞上特异性表达。

除了RNAscope®技术外，作者也大量使用免疫荧光技术、以及RNAscope® ISH-IF双染，对单细胞RNA-seq数据进行验证。

该研究利用单细胞RNA-seq技术，成功绘制了有序的人类精子发生过程，为人类精原干细胞维持、精子发生、减数分裂的研究、以及临床男性不育的诊断和治疗提供了全新的指导。

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RNAscope® ISH 技术 是由美国 Bio-techne 旗下 Advanced Cell Diagnostics (ACD) 公司研发的 RNA 原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope® ISH 技术属于新一代 RNA 原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链 RNA 探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高灵敏度地检测到目标 RNA。该方法的具体优势如下：

◆应用广泛: 使用RNAscope® ISH 技术，靶点 RNA 为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而 RNAscope 技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。

◆ 特异性：RNAscope® 独特的双Z (ZZ) 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要 2~4 周时间即可完成。

◆ 灵敏度：RNAscope® ISH 技术检测每个 RNA 分子时，只需三对双Z (ZZ) 探针即可完成杂交和信号可视化。

◆ 单分子可视化和单细胞定量: 使用 RNAscope® ISH 技术杂交上三对及以上双Z探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号，更可借助分析软件定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

◆ 兼容降解的RNA: 由于仅利用三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

◆ 检测结果稳定一致性：由于工业化合成 RNAscope® ISH 技术用到的探针以及所有检测试剂，且该技术针对不同样本类型 (冰冻切片，石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等) 已经有成熟的实验操作流程，故使得 RNAscope® ISH 技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在 Leica 以及罗氏 Ventana 自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

◆多通道多靶点同时检测：由于 RNAscope® ISH 技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在化学发光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。

参考文献:

1. Yu, Z. et al. Hoxc-Dependent Mesenchymal Niche Heterogeneity Drives Regional Hair Follicle Regeneration. Cell Stem Cell 23, 487-500 e486, doi:10.1016/j.stem.2018.07.016 (2018).

2. Wang, M. et al. Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis. Cell Stem Cell 23, 599-614 e594, doi:10.1016/j.stem.2018.08.007 (2018).